Toto sa'o PCR Kit
Numera pusi: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit e fetaui lelei mo le faʻalauteleina saʻo o laulaau, fatu, ma isi, ma e mafai ona faʻaogaina mo suʻesuʻega maualuga o laʻau faʻataʻitaʻiga e le o iai polysaccharides ma polyphenols.O le DNA polymerase fa'alautele tuusa'o e fa'avae i luga o le evolusione fa'atonu e sili atu le fa'apalepale i le PCR inhibitors i la'au.I le taimi nei, o loʻo faʻatumauina le maualuga o le faʻatinoina o galuega, lea e talafeagai mo le faʻalauteleina o vaega DNA i totonu ole 5 kb.O le Lysis buffer A tulaga ese i totonu o le pusa e mafai ona fa'aoga e fa'amama ai aano o la'au fou pe aisa.E faigofie ona faʻaogaina ma e mafai ona faʻaaogaina le lysate e fai ma faʻataʻitaʻiga mo le faʻalauteleina e aunoa ma le faʻamamaina.O le faiga o lo'o iai ni mea e puipuia ai e mafai ai ona fa'asili lelei fa'ata'ita'iga mama pe a mae'a fa'a'aisa ma fa'asafu.2 × Plant Direct Master Mix na'o le mana'omia o le fa'aopoopoina o primers ma fa'ata'ita'iga e fa'atino ai le fa'atupu fa'ateleina o tali, ma fa'aitiitia ai le fa'aogaina o paipa ma fa'aleleia atili le fa'atinoina ma le toe gaosia o fa'ai'uga.
Vaega
| Vaega | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × La'au Tu'usa'o Master Mix | 1.25 ml | 4×1.25 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer A | 5 ml | 20 ml |
| La'au Tu'usa'o Lysis Pa'u B* | 5 ml | 20 ml |
*O le La'au Tu'usa'o Lysis Pa'u B ose mea fa'apipi'i e filifili, lea e fa'aaogaina e fa'ate'a'ese ai La'au Tu'usa'o Lysis Buffer A mo le fa'aumiumi o le taimi e teu ai fa'ata'ita'iga.E mafai ona faʻaaogaina e tusa ai ma le tulaga moni.
Tulaga Teuteu
2 × Plant Direct Master Mix, teu i le -30 ~ -15 ℃ ma aloese mai le fa'amalo fa'asolo ma le fa'afefe;La'au Tu'usa'o Lysis Buffer, teu i le -30 ~ -15℃ po'o le 2 ~ 8℃.
Fa'ata'ita'iga Fa'agasologa
Fa'ata'ita'iga Fa'agasologa–Laulaau La'au
Auala tuusao:E fautuaina le faʻaaogaina o laulaau laiti.Fa'aaoga se pu'u fa'atasi ma le fa'amautu o le 0.5 - 3 mm e maua ai se fa'ata'ita'iga la'ititi ma tutusa, ona fa'aopoopo sa'o lea o le fa'ata'ita'iga ile PCR system (50 μl system e fautuaina).Manatua, ia mautinoa o le faʻataʻitaʻiga o loʻo i totonu o le PCR solution ae le o le puipui o le paipa.Afai ole PCR tuusa'o e fa'aogaina e fa'alautele ai vaega uumi ma fa'ata'ita'iga lavelave, ole fa'aogaina o se fa'ata'ita'iga e la'ititi la'ititi (0.5 - 1 mm) e fai ma fa'ata'ita'iga e mafai ona fesoasoani e maua ai fa'ai'uga lelei.
Ole auala ole lysis:E fautuaina le faʻaaogaina o laulaau laiti.Ave se tamai fasi laulaau (pe a ma le 1 - 3 mm le lautele), tuʻu i le 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, ma olo i le tele e mafai ai (o lenei laasaga e mafai ona faia e ala i le oomiina o le lau i le 100 μl pipette pito. e palu le fa'ata'ita'iga).Afai e faʻaaogaina le tele o voluma o laulaʻau (aua le sili atu i le 7 mm), faʻateleina le voluma o le faʻafefeteina i le 50 μl.A maeʻa lau laulaau, e tatau ona foliga lanu meamata le vaifofo.A maeʻa se centrifugation puupuu, faʻaopopo le 1 μl o le supernatant i le PCR system e fai ma faʻataʻitaʻiga tali.
Metotia lysis vevela:E fautuaina le faʻaaogaina o laulaau laiti.Ave se tamai fasi laulaau (pe a ma le 1 - 3 mm le lautele), tuʻu i le 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ma faʻamafanafana i le 95 ° C mo le 5 - 10 min.Ole taimi ole lysis e mafai ona fa'aopoopoina mo laulaau e faigata ona lise (e le sili atu ile 20 min).Afai e faʻaaogaina le tele o voluma o laulaʻau (e le sili atu i le 7 mm), faʻateleina le voluma o le faʻamaʻi faʻafefe i le 50 μl.A mae'a fa'avevela, fa'anofo fa'apu'upu'u, ma fa'aopoopo le 1 μl o le supernatant i le PCR system e fai ma fa'ata'ita'iga tali.
Fa'ata'ita'iga Fa'agasologa– Fatu La’au
Ole auala ole lysis:Fa'aaoga se scalpel e tipi ai fatu e 5 mm le lautele, fa'aopoopo i le 100 μl o Plant Direct Lysis Buffer A, ma olo le fa'ata'ita'iga i se pito paipa po'o isi mea faigaluega.Vortex pu'upu'u ma tu'u i le vevela o le potu mo le 3 - 5 min.Ia mautinoa o lo'o magoto le fa'ata'ita'iga o fatu i totonu o le fa'apalapala fa'afefete.A maeʻa sina faʻamalo puupuu, faʻaopopo le 1 μl o le supernatant i le PCR system e fai ma faʻataʻitaʻiga tali.
Metotia lysis vevela:Fa'aaoga se scalpel e tipi ai fatu e 5 mm le lautele, fa'aopoopo i le 100 μl o Plant Direct Lysis Buffer A, ma fa'avela ile 95°C mo le 5 - 10 min.Ole taimi ole lysis e mafai ona fa'aopoopoina mo laulaau e faigata ona lise (e le sili atu ile 30 min).A mae'a fa'avevela, fa'a'ese'ese pu'upu'u, ma fa'aopoopo le 1 μl supernatant ile PCR system e fai ma fa'ata'ita'iga tali.
a.E mafai fo'i ona fa'aoga seleulu po'o isi mea faigaluega e tipi ai fa'ata'ita'iga o le lapo'a talafeagai;afai e toe fa'aoga le tu'i po'o le seleulu, e tatau ona fa'amama i le 2% sodium hypochlorite solution a'o le'i fa'aoga ta'itasi e puipuia ai le fa'a'ese'esega i le va o fa'ata'ita'iga.
e.Ia mautinoa o le Plant Direct Lysis Buffer ua liusuavai atoa a'o le'i fa'aogaina.Afai e viscous le pa'u pe iai fo'i fa'afefete, e mafai ona fa'avevela ile 37 ℃ e liusua uma ai a'o le'i fa'aoga.
i.Ole tele ole fa'ata'ita'iga ile faiga ole tali e mafai ona fetu'una'i talafeagai e tusa ai ma le eseesega i le tele o mea fa'ato'aga ma fa'aopoopo mea fa'afefiloi.
La'au Tu'usa'o Lysis Buffer
O le Plant Direct Lysis Buffer A o loʻo i totonu o lenei oloa ua matua faʻamaonia e faʻamatuʻu ai le genome o le tele o auga o laʻau ma e talafeagai mo le teuina mo se taimi pupuu o laʻau mama i le 4 ℃.Afai e manaʻomia le teuina o le faʻataʻitaʻiga mo se taimi umi (faʻataʻitaʻiga, 1 - 2 masina), e fautuaina e tuʻuina atu le supernatant i se EP fou ma teu i le -20 ℃.Ina ia teuina faʻataʻitaʻiga sili atu ona mautu, faʻaopopo se voluma tutusa o le Plant Direct Lysis Buffer B i le supernatant fesiitai, faʻafefiloi lelei ma teu i le -20℃.O le taimi e teu ai mautu e eseese ma fa'ata'ita'iga o la'au ma setete.
Reaction System
| ddH2O | I le 20.0 µl | I le 50.0 µl |
| 2 × La'au Tu'usa'o Master Mixa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Muamua 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Muamua 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Fa'ata'ita'iga laula'au la'au/su'i(Va'ai ile Fa'ata'ita'iga Fa'agasologa) | 0.5 – 3 mm lau tisiki/x µl | 0.5 – 3 mm lau tisiki/x µl |
a.O loʻo iai Mg2+i se faʻasalaga mulimuli o le 2 mM.
e.E fautuaina le fa'aogaina o le fa'ai'uga mulimuli o le 0.4μM mo fa'amuamua ta'itasi.O le fa'aogaina tele o fa'amatamua o le a ta'ita'iina ai le fa'atuputeleina o fa'aliga e le fa'apitoa.
i.Ole aofaʻi ole faʻataʻitaʻiga faʻaaogaina e mafai ona fetuunai e tusa ai ma le tulaga moni.Ole aofa'i ole fa'aogaina ile tasi tali ole fa'ata'ita'iga fa'a'a'ai mama e mafai ona fetu'una'i ile va ole 2% - 20% ole aofa'i atoa ole tali.O le fa'aaogaina tele o fa'ata'ita'iga e mafai ona fa'aletonu ai le fa'alauteleina.
Polokalama Tali
| Laasaga | vevela | Taimi |
| Uluai Denaturation | 98℃ | 5 minu |
| Denaturation | 95℃ | 10 sec |
| Fa'asusu | 58 ~ 72 ℃ | 15 sec |
| Fa'aopoopoga | 72 ℃ | 30 sec |
| Fa'aopoopo Mulimuli | 72 ℃ | 5 minu |
a.Uluai Denaturation (98 ℃, 5 min) fa'aolaina le lysis o aano o la'au, fa'asa'oloto DNA genomic e mafai ona fa'aoga mo le PCR fa'ateleina.Aua le faapuupuuina le taimi pe faaitiitia le vevela.
e.E fautuaina e fa'atutu tutusa ma le tau Tm muamua po'o le 2 ~ 4℃ maualuga atu nai lo le tau Tm.O le faʻaogaina saʻo o le DNA polymerase o loʻo faʻaaogaina i lenei oloa e ese mai le masani Taq DNA polymerase, ma e iai manaʻoga faʻapitoa mo le faʻafefeteina o le vevela; o le faʻaogaina o le maualuga o le vevela e mafai ona faʻaitiitia ai le faʻalauteleina o le le faʻapitoa ma faʻaleleia le faʻaleleia lelei.Mo faʻataʻitaʻiga lavelave, e mafai ona ausia le faʻaleleia lelei e ala i le fetuunaiga o le vevela o le annealing ma faʻaumiumi taimi faʻalautele.
i.Afai o le umi o le oloa faʻalauteleina o le ≤1 kb, o le taimi faʻaopoopo e seti i le 30 sec / kb;afai o le umi o le oloa faʻateleina o le> 1 kb, o le taimi faʻaopoopo e seti i le 60 sec/kb.
o.Mo faʻataʻitaʻiga lavelave poʻo faʻataʻitaʻiga e maualalo le faʻalauteleina o le gaosiga, o le aofaʻi o taʻamilosaga e mafai ona faʻatupuina lelei ile 40 -50 taamilosaga.
Talosaga
E fa'atatau mo le fa'asili sa'o o auga o la'au ma su'esu'ega maualuga o la'au fa'ata'ita'iga e leai ni polysaccharides ma polyphenols.
Fa'amatalaga
Mo na'o su'esu'ega fa'aoga.E le mo le faʻaaogaina i faʻataʻitaʻiga faʻamaonia.
1. Mo le fa'alauteleina o la'au fa'atauva'a po'o le fa'alauteleina sa'o, e fautuaina le fa'aogaina o le DNA genomic fa'amama e fai ma fa'atonuga lelei a'o le'i amataina le fa'ata'ita'iga ina ia fa'amautinoa e sa'o le faiga, fa'amuamua ma fa'agaioiga.
2. O le DNA polymerase fa'aopoopo sa'o o lo'o fa'aogaina i totonu o lenei pusa e malosi lona fa'atonuga.Afai e manaʻomia le faia o le TA cloning, e fautuaina e faʻamamā le DNA aʻo leʻi faʻaopoopoina le adenine.
3. Taiala Fuafuaga Muamua:
a.E fautuaina o le fa'avae mulimuli i le 3' pito o le mea muamua e tatau ona G po'o C.
e.E tatau ona 'alofia fa'agasologa soso'o i fa'avae mulimuli e 8 i le pito 3' ole fa'amuamua.i.Aloese mai le fa'apipi'iina o lauulu i le pito 3' ole fa'amatamata.
o.Eseesega i le Tm tau o le muamua muamua ma le pito i tua e le tatau ona sili atu i le 1 ℃ ma le tau Tm e tatau ona fetuutuunai i le 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 ua fautuaina e fuafua le tau Tm).
u.O fa'asologa fa'aopoopo fa'aopoopo muamua e le'o fetaui ma le fa'ata'ita'iga, e le tatau ona fa'aofiina pe a fa'atatau le tau Tm muamua.
f.E fautuaina o le GC o loʻo i totonu o le mea muamua e 40% -60%.
g.O le tufatufaina atoa o le A, G, C ma le T i le mea muamua e tatau ona tutusa lelei.Aloese mai le fa'aogaina o itulagi e maualuga le GC po'o le AT.
h.Aloese mai le iai o fa'asologa fa'aopoopo o fa'avae e 5 pe sili atu a le i totonu o le fa'avae po'o le va o fa'avae se lua ma aloese mai le i ai o fa'asologa fa'atasi o fa'avae e 3 pe sili atu i le pito 3' o fa'avae e lua.
i.Fa'aaoga le NCBI BLAST galuega e siaki ai le fa'apitoa o le fa'avae e puipuia ai le fa'atuputeleina le fa'apitoa.
