M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase ose fa'aliliuga fa'aliliu na maua e ala ile su'esu'eina o suiga ole kenera M-MLV ole Moloney murine leukemia virus na tupuga ma fa'amatalaga ile E.coli.O le enzyme e aveese ai le gaioiga RNase H, e maualuga atu le faapalepale o le vevela, ma e talafeagai mo le maualuga o le vevela faʻaliliuga.O le mea lea, e fesoasoani tele mo le faʻaumatiaina o aʻafiaga le lelei o le RNA maualuga maualuga fausaga ma mea e le faʻapitoa i luga o le cDNA synthesis, ma e maualuga atu le mautu ma le faʻaliliuina o le faʻasologa o tusitusiga.O le enzyme e maualuga atu le mautu ma toe fa'aliliu le fa'asologa o tusitusiga.
Vaega
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Fa'apolopolo Muamua (filifiliga)
* 5 × First-Strand Buffer e le o iai le dNTP, fa'amolemole fa'aopoopo dNTPs pe a saunia le faiga fa'afoliga
Talosaga Fautuaina
1.Laasaga tasi qRT-PCR.
2.Su'esu'eina o le virusi RNA.
Tulaga Teuteu
-20°C mo le teuina umi, e tatau ona fa'afefiloi lelei a'o le'i fa'aogaina, aloese mai le fa'a'aisa fa'asao.
Fa'amatalaga Vaega
E tasi le iunite e aofia ai le 1 nmol o le dTTP i le 10 minute i le 37°C e fa'aaoga ai le poly(A)•oligo(dT)25e fai ma fa'ata'ita'iga/muamua.
Puleaina lelei
1.SDS-PAGE electrophoretic mama sili atu nai lo le 98%.
2.Fa'aola maaleale, fa'atonuga fa'aputuga, mautu.
3.Leai se gaioiga fa'atosina, leai se endonuclease po'o le fa'aleagaina o le exonuclease.
Fa'atonuga o Tali mo Fofo Fa'asagaga Muamua
1.Sauniuniga o le paluga tali
| Vaega | Volume |
| Oligo(dT)12-18 Palemia po'o Fa'ailoga Fa'afuainumeraa Po'o Gene Specific Primersb | 50 pml |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Fa'ata'ita'iga RNA | Aofa'i RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-saoloto dH2O | I le 10 μL |
Fa'amatalaga:a/b: Fa'amolemole filifili ituaiga eseese o primer e tusa ai ma ou mana'oga fa'ata'ita'i.
2.Fa'avela ile 65°C mo le 5 minute ma fa'alili vave ile aisa mo le 2 minute.
3.Faaopopo vaega nei i le faiga o loʻo i luga i le aofaʻi atoa o le 20μL ma faʻafefiloi malie:
| Vaega | Volume (μL) |
| 5 × Fa'apolopolo Muamua | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| RNase-saoloto dH2O | E oʻo i le 20 μL |
4. Fa'amolemole fai le tali e tusa ai ma tulaga nei:
(1) Afai e faʻaaogaina Random Primer, e tatau ona faia le tali ile 25 ℃ mo le 10mins, ona sosoo ai lea ma le 50 ℃ mo le 30 ~ 60mins;
(2) Afai e faʻaaogaina Oligo dT poʻo faʻamatalaga faʻapitoa, e tatau ona faia le tali ile 50 ℃ mo le 30 ~ 60mins.
5.Fa'avevela ile 95℃ mo le 5mins e fa'agata ai le Neoscript Reverse Transcriptase ma fa'amuta ai le tali.
6.E mafai ona fa'aoga sa'o oloa fa'aliliuga i le PCR reaction ma fluorescence quantitative PCR reaction, pe teuina ile -20℃ mo se taimi umi.
PCR Rgaioiga:
1.Sauniuniga o le paluga tali
| Vaega | Fa'atotonuga |
| 10 × PCR Buffer (dNTP free, Mg²+ free) | 1× |
| dNTPs (10mM ta'itasi dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Muamua 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Muamua 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Fa'ata'ita'igaa | ≤10% Fofo Fa'asaga Muamua (2 μL) |
| ddH2O | I le 50 μL |
Fa'amatalaga:a: Afai e tele naua muamua filifili tali fa'aopoopo fofo, o le PCR tali e mafai ona taofia.
2.Fa'atonuga ole PCR
| Laa | vevela | Taimi | Ta'amilosaga |
| mua'i denaturation | 95℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 10-20 sec | 30-40 |
| Fa'asusu | 50-60 ℃ | 10-30 sec | |
| Fa'aopoopoga | 72 ℃ | 10-60 sec |
Fa'amatalaga
1.E fetaui lelei mo le fa'aliliuina o le vevela o le vevela i le va o le 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.E sili atu le mautu, e fetaui lelei mo le maualuga o le vevela o le faʻaliliuina o faʻaliliuga.E le gata i lea, e lelei mo le uia lelei i vaega faigata o le RNA.E le gata i lea, ee talafeagai mo le tasi-laasaga multiplex fluorescence quantitative RT-PCR suʻesuʻega.
3.Le fetaui lelei ma enzymes amplification PCR eseese ma e talafeagai mo tali maualuga RT-PCR.
4.E fetaui lelei mo le maualuga o le tasi-step fluorescence quantitative RT-PCR reaction, faʻaleleia lelei le fua o le suʻesuʻeina o le maualalo o faʻataʻitaʻiga.
5.E talafeagai mo le fausiaina o faletusi cDNA.
