Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG poʻo UDG) o se faʻapipiʻi faʻapipiʻi o le E.coli ma le mamafa o le mole o le 25 kDa.E fa'atupuina le tu'uina atu o le uracil saoloto mai le uracil-o lo'o i ai le DNA tasi ma le fa'alua fa'alua, ma e le o toaga i le RNA, ma e mafai ona fa'aoga e puipuia ai le fa'aleagaina o mea fa'aopoopo PCR.O le mataupu faavae o le gaioiga e faʻavae i luga o le mea moni e faapea afai o le dUTP e suitulaga i le dTTP i le PCR reaction ma se PCR amplification product o loʻo i ai faʻavae dU ua fausia, e mafai e le enzyme ona filifili faʻamavae le fusi glycosidic o U faʻavae i le tasi-stranded ma le lua-stranded. DNA ma faʻaleagaina le oloa faʻateleina PCR.
Talosaga Fautuaina
Fa'ateleina le Puipuia o le Fa'aleagaina
Tulaga Teuteu
-20°C mo le teuina umi, e tatau ona fa'afefiloi lelei a'o le'i fa'aogaina, aloese mai le fa'a'aisa fa'asao.
Taofi puipui
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glycerol.
Fa'amatalaga Vaega
Ole aofa'i ole enzyme e mana'omia e fa'aleagaina ai le 1µg ole DNA pipii tasi o lo'o iai fa'avae dU ile 1 itula ile 37°C e 1 le iunite.
Puleaina lelei
1.SDS-PAGE electrophoretic mama sili atu nai lo le 98%
2.Fa'aola maaleale, fa'atonuga fa'atutusa, mautu
3.A maeʻa ona togafitia le 1U o le UNG i le 50 ℃ mo le 2mins, o le faʻataʻitaʻiga o loʻo iai U i lalo ole 103 kopi e tatau ona faʻaleagaina atoa ma e leai se mea faʻalauteleina e mafai ona gaosia.
4.Leai se gaioiga fa'atosina mai fafo
Faatonuga
| Vaega | Volume (μL) | Fa'atonuga mulimuli |
| 10 × PCR Buffer (dNTP free, Mg²+fua) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (sui le dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Fa'afefiloi Muamuaa | 2 | 1× |
| Fa'ata'ita'iga | - | <1μg/gai |
| ddH₂O | I le 50 | - |
Fa'aaliga: a: Afai e faʻaaogaina mo le qPCR/qRT-PCR, e tatau ona faʻaopoopo le suʻesuʻega fluorescent i totonu o le faiga tali.E masani lava, o se fa'auluuluga fa'ai'uga mulimuli o le 0.2 μM e mafai ona maua ai fa'ai'uga lelei;pe a le lelei le faʻatinoga o tali, e mafai ona fetuunai le faʻatonuga muamua i le va o le 0.2-1 μM.E masani lava, o le suʻega suʻesuʻe e sili ona lelei i le va o le 0.1-0.3 μM.E mafai ona faia fa'ata'ita'iga fa'agasologa fa'atotonu e su'e ai le tu'ufa'atasiga sili o le fa'avae ma le su'ega.
Fa'amatalaga
1.E mafai ona fa'aogaina le enzyme UNG e aveese ai oloa fa'ateleina o le dUTP ua fa'aleagaina mai le faiga fa'afoliga a'o le'i faia le tali a le PCR, ona 'alofia ai lea o fa'ai'uga sese ona o le fa'aleagaina o oloa.
2.O le vevela sili ona lelei mo le enzyme UNG e faʻaaogaina i le faʻaogaina o le PCR faʻamaʻi e masani lava 50 ℃ mo le 2mins;le tulaga inactivation e 95 ℃ mo 5mins.
3.Aloese mai le fa'a'aisa soo, ma 'aua ne'i fa'aalia i suiga tetele o le vevela.
4.O kenera eseese e faʻalauteleina e eseese le faʻaogaina o le dUTP ma le faʻaogaina o le UNG enzyme, o le mea lea, afai o le faʻaogaina o le UNG system e oʻo atu ai i le faʻaitiitia o le faʻaogaina o le faʻaogaina, e tatau ona fetuunaʻi ma faʻaleleia le faiga tali, pe a manaʻomia le lagolago faʻapitoa, faʻamolemole faʻafesoʻotaʻi. la matou kamupani.
