RTL Reverse Transcriptase
O le RTL reverse transcriptase o se DNA polymerase fa'alagolago i le RNA template e leai se gaioiga 3'→5' exonuclease ma e iai le gaioiga RNase H.E mafai e lenei enzyme ona fa'aogaina le RNA e fai ma fa'ata'ita'iga e fa'apipi'i ai se fusi fa'atasi o le DNA, lea e mafai ona fa'aoga i le fa'asologa muamua o le cDNA, aemaise lava mo le RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).Pe a faʻatusatusa i le RTL reverse transcriptase 1.0, o le faʻalogona ua matua faʻaleleia, o le faʻamautuina o le vevela e sili atu le malosi, ma o le tali i le 65 ° C e sili atu ona mautu.RTL reverse transcriptase (glycerol free) e mafai ona fa'aoga e saunia ai tapenaga fa'a lyophilized, lyophilized RT-LAMP reagents ma isi.
Fa'amatalaga Vaega
E tasi le iunite e tu'ufa'atasia le 1 nmol o le dTTP i mea e mafai ona fa'asa'o i le acid i totonu ole 20 minute ile 50°C ile fa'aogaina ole poly(A)•oligo(dT)25 e fai ma fa'ata'ita'iga-primer.
Vaega
| Vaega | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Glycerol-free) (15U/μL) | 0.1 mL | 1 mL | 10 ml |
| 10×HC RTL Pa'u | 1.5 mL | 4×1.5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2×1.5 mL | 3×10 mL |
Tulaga Teuteu
Felauaiga i lalo ole 0°C ma ia teuina ile -25°C~-15°C.
Puleaina lelei
- Toega Gaoioiga oEndonuclease:O se tali 50 μL o loʻo i ai le 1 μg o le λDNA ma le 15 iunite o le RTL2.0 faʻapipiʻiina mo le 16 itula i le 37 ℃ o loʻo faʻaalia ai le mamanu tutusa e pei o le pulea lelei e le electrophoresis gel.
- Toega Gaoioiga oExonuclease:O se tali 50 μL o loʻo i ai le 1 μg o Hind Ⅲ digested λDNA ma 15 iunite o le RTL2.0 faʻapipiʻiina mo le 16 itula i le 37 ℃ o loʻo faʻaalia ai le mamanu tutusa e pei o le pulea lelei e gel electrophoresis.
- Toega Gaoioiga oNickase:O se tali 50 μL o loʻo i ai le 1 μg o le supercoiled pBR322 ma le 15 iunite o le RTL2.0 faʻapipiʻiina mo le 4 itula i le 37 ° C o loʻo faʻaalia ai le mamanu tutusa e pei o le pulea lelei e le electrophoresis gel.
- Toega Gaoioiga oRNase:O se tali 10 μL o loʻo i ai le 0.48 μg o MS2 RNA ma le 15 iunite o le RTL2.0 faʻapipiʻiina mo le 4 itula i le 37 ° C o loʻo faʻaalia ai le mamanu tutusa e pei o le pulea lelei e le electrophoresis gel.
- E. coli gDNA:Fuaina maE.colipusa fa'apitoa HCD, 15 iunite o le RTL2.0 o lo'o i lalo ifo o le 1E. coligenome.
Seti Tali
cDNA Synthesis Protocol
| Vaega | Volume |
| Fa'ata'ita'iga RNA a | faitalia |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) po'o Fa'afefiloi Fa'ailoga Fa'afua (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM ta'itasi) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL Pa'u | 2 μL |
| Vai e leai se nuclease | E oʻo atu i le 20 μL |
Fa'amatalaga:
1) Ole fua fautuaina ole Aofa'i RNA ole 1ng~1μg
2) Ole fua fautuaina ole mRNA ole 50ng~100ng
Thermo-tietie uila Tulaga mo se masani tali:
| Vevela (°C) | Taimi |
| 25 °Ca | 5min |
| 55 °C | 10minb |
| 80 °C | 10min |
Fa'amatalaga:
1) Afai e fa'aogaina le Fa'afefiloi Fa'atosina, ose la'asaga fa'ato'a ile 25°C.
2) Afai e fa'aogaina le fa'afefiloi muamua, se la'asaga fa'ato'a ile 55°C mo le 10~30mins.
RT-LAMP Protocol
| Vaega | Volume | Fa'ai'uga Fa'amau |
| Fa'ata'ita'iga RNA | faitalia | ≥10 kopi |
| dNTP Mix (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| FIP/BIP Ulua'i (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Muamua (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primer (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Tali |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Tali |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Ta'i |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Aofa'i 8 mM) |
| 10×HC RTL Pa'u (po'o le 10×HC Bst V2 Pa'u) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Vai e leai se nuclease | E oʻo atu i le 25 μL | - |
Fa'amatalaga:
1) Faafefiloi e ala i le vortex ma centrifuge puupuu e aoina.Taofi le vevela tumau ile 65°C mo le 1 itula.
2) O paʻu e lua e fesoʻotaʻi ma e tutusa le tuʻufaʻatasiga.
Fa'amatalaga
1.O lenei oloa o le a fausia ai se paʻepaʻe paʻepaʻe pe a teuina i -20 °C.Aveese mai le -20°C ma tuu i luga o le aisa mo le tusa ma le 10 minute.A uma ona liusuavai, e mafai ona faʻaaogaina e ala i le lulu ma faʻafefiloi.
2. O le oloa cDNA e mafai ona teuina i -20 ° C poʻo -80 ° C pe faʻaaoga vave mo PCR tali.
3. Ina ia puipuia le faʻaleagaina o le RNase, faʻamolemole tausia le nofoaga faʻataʻitaʻi mama, ma fai totigilima mama ma matapulepule i le taimi o le taotoga.
