Pusa Genotyping Isu

Numera pusi: HCR2021A

O lenei oloa o se pusa ua fuafuaina mo le vave iloagofie o genotypes isumu, e aofia ai le DNA crude extraction ma le PCR amplification system.O le oloa e mafai ona fa'aoga mo le fa'alauteleina o le PCR sa'o mai le si'usi'u o isumu, taliga, tamatama'i vae ma isi a'a pe a uma ona fa'amama faigofie e Lysis Buffer ma Proteinase k.Leai se fa'aliga o le po, phenol-chloroform extraction po'o le fa'amamāina o koluma, lea e faigofie ma fa'apu'upu'u le taimi e alu ai su'ega.O le oloa e talafeagai mo le faʻalauteleina o vaega faʻatatau e oʻo atu i le 2kb ma multiplex PCR reactions ma e oʻo atu i le 3 paipa o primers.O le 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix e iai le DNA polymerase, Mg²⁺, dNTPs ma se faiga faʻapipiʻi sili ona lelei e tuʻuina atu ai le maualuga o le faʻamalosia ma le faʻapalepale faʻapalepale, ina ia mafai ona faʻatino tali PCR e ala i le faʻaopoopoina o faʻataʻitaʻiga ma primers ma toe faʻaleleia le oloa ile 1 ×.O le oloa PCR ua fa'ateleina i lenei oloa o lo'o i ai se fa'avae iloga "A" i le fa'ai'uga 3' ma e mafai ona fa'aoga sa'o mo le TA cloning pe a uma ona fa'amamāina.

Vaega

Tulaga Teuteu

O oloa e tatau ona teuina ile -25~-15℃ mo le 2 tausaga.A maeʻa ona faʻafefe, e mafai ona teuina le Lysis Buffer i le 2 ~ 8 ℃ mo le faʻaaogaina o taimi pupuu, ma faʻafefiloi lelei pe a faʻaaoga.

Fa'aaogāga

O lenei oloa e talafeagai mo suʻesuʻega tuʻituʻi isumu, suʻesuʻega transgenic, genotyping ma isi.

Vaega

1.Fa'agaoioiga faigofie: leai se mana'oga e aveese mai le genomic DNA;

2.Fa'aoga lautele: talafeagai mo le fa'alauteleina sa'o o masini isumu eseese.

Faatonuga

1.Fa'asa'olotoina o le genomic DNA

1) Saunia o le lysate

Tissue lysate ua saunia e tusa ai ma le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga o isumu e faʻamama (e tatau ona saunia le lysate i luga ole laiga e tusa ai ma le fua ma faʻafefiloi maeʻaeʻa mo le faʻaaogaina), ma o le vaega o reagents e manaʻomia mo se faʻataʻitaʻiga e tasi e faʻapea:

2) Fa'ata'ita'iga Sauniuniga ma Lysis

Fa'aaogā Tissue Fautuaina

Ave se aofa'iga talafeagai o fa'ata'ita'iga a le isumu i totonu o fa'amama centrifuge mama, fa'aopoopo le 200μL o le lysate fou fou i paipa centrifuge ta'itasi, vortex ma lulu, ona fa'asusu lea i le 55℃ mo le 30mins, ona vevela lea ile 98℃ mo le 3mins.

3) Centrifugation

Lulu lelei le lysate ma centrifuge i le 12,000 rpm mo le 5 minute.O le supernatant e mafai ona faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga mo le PCR amplification.Afai e manaʻomia le faʻataʻitaʻiga mo le teuina, faʻafeiloaʻi le supernatant i se isi paipa centrifuge sterile ma teu i le -20 ℃ mo le 2 vaiaso.

2.Fa'ateleina PCR

Ave'ese le 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix mai le -20 ℃ ma liusuavai ile aisa, fa'afefiloi i luga ma saunia le PCR reaction system e tusa ai ma le laulau o lo'o i lalo (fa'agaoi ile aisa):

Fa'aaliga:

a) O le aofaʻi faʻaopoopo e le tatau ona sili atu i le 1/10 o le faiga, ma afai e faʻaopoopo tele, e mafai ona faʻalavelaveina le PCR amplification.

Tulaga Fautuaina PCR

Fa'aaliga:

a) Faʻamauina vevela: Faʻatatau i le Tm tau o le faʻavae, e fautuaina e seti le vevela faʻafefe i le laʻititi Tm tau o le faʻavae + 3 ~ 5 ℃.

Faafitauli masani ma Fofo

1.Leai ni fasipepa fa'atatau

1) Oloa lysis tele.Filifili le aofaʻi sili ona talafeagai o faʻataʻitaʻiga, e masani lava e le sili atu i le 1/10 o le faiga;

2) Tele tele fa'ata'ita'iga lapo'a.Fa'asusu le lysate 10 taimi ona fa'ateleina lea, pe fa'aititia le lapo'a fa'ata'ita'i ma toe fa'amama;

3) E le fou ni fa'ata'ita'iga o tisi.E fautuaina le fa'aogaina o ni mea'ai fou;

4) Le lelei tulaga muamua.Fa'aoga le DNA genomic mo le fa'ateleina e fa'amaonia ai le tulaga lelei ma fa'amalieina le mamanu muamua.

2.Fa'aliga lē fa'apitoa

1) E maualalo tele le vevela o le annealing ma maualuga tele le numera o le taamilosaga.Faʻateleina le vevela faʻafefe ma faʻaitiitia le numera o taamilosaga;

2) O le fa'atonuga fa'atusa e maualuga tele.Fa'aitiitia le aofa'i o fa'ata'ita'iga po'o fa'afefete le fa'ata'ita'iga fa'a 10 taimi pe'a uma ona fa'ateleina;

3) Le lelei tulaga fa'apitoa.Fa'alelei le mamanu muamua.

Fa'amatalaga

1.Ina ia aloese mai le faʻaleagaina i le va o faʻataʻitaʻiga, e tatau ona saunia le tele o meafaigaluega faʻataʻitaʻiga, ma e mafai ona faʻamama le pito i luga o meafaigaluega i le 2% sodium hypochlorite solution poʻo le nucleic acid cleaner pe a uma faʻataʻitaʻiga taʻitasi pe a manaʻomia le faʻaaogaina faifaipea.

2.E fautuaina le fa'aogaina o masini isumu fou, ma e le tatau ona tele naua le voluma fa'ata'ita'iga e 'alofia ai le a'afiaina o i'uga o le fa'ateleina.

3.Lysis Buffer e tatau ona aloese mai le fa'a'aisa soo, ma e mafai ona teuina i le 2 ~ 8 ℃ mo taimi pupuu fa'aoga tele.Afai e teuina i le maualalo o le vevela, e mafai ona tupu le timu, ma e tatau ona faʻamavae atoa aʻo leʻi faʻaaogaina.

4.O le PCR Mix e tatau ona aloese mai le fa'a'aisa soo, ma e mafai ona teuina i le 4 ℃ mo le fa'aoga faifaipea mo se taimi pupuu.

5.O lenei oloa e mo na'o su'esu'ega fa'asaienisi ma e le tatau ona fa'aogaina i su'esu'ega fa'apitoa po'o togafitiga.