EndoFree Plasmid Maxi Kit
O lenei pusa e fetaui lelei mo le faʻaaogaina mai le 150 - 300 ml o vaifofo siama na faʻatupuina i le po, e faʻaogaina ai le SDS-alkaline lysis method e faʻamama ai le siama.O le fa'aputuga fa'atauva'a o lo'o tu'ufa'atasia fa'atasi ma se Endotoxin Scavenger tulaga ese ma tu'u'ese'ese ile centrifugation e aveese ai endotoxins.Ona, o le silica gel membrane filifili filifili i le plasmid DNA i le fofo i lalo o tulaga o le maualuga-masima ma maualalo-pH.Ona soso'o ai lea ma le fa'aopoopoina o le fa'amama fufulu e aveese ai mea leaga ma isi vaega fa'ama'i.Ma le mea mulimuli, o se masima maualalo, maualuga-pH elution buffer e faʻaaogaina e faʻafefe ai le DNA plasmid mama mai le membrane matrix silicon.O le silica gel membrane o loʻo faʻaaogaina faʻapitoa adsorption membrane, ma o le eseesega o le aofaʻi o le adsorption i le va o le koluma ma le koluma e laʻititi tele ma e lelei le toe faʻaleleia.E le mana'omia le Phenol, chloroform ma isi vaila'au o'ona, ma e le'o fa'apena fo'i ni laasaga o le fa'afefe o le ethanol.O lenei pusa e mafai ona faʻaaogaina e faʻavaveina ai le 0.2 -1.5 mg o le DNA plasmid kopi maualuga mama, faʻatasi ai ma le fua faʻatatau o le 80% -90%.O lo'o fa'aogaina e le pusa se faiga fa'apitoa e aveese ai le endotoxin, e matua'i maualalo le anotusi o le endotoxin ma e lelei tele le a'afiaga o le felauaiga.O le plasmid na maua mai e mafai ona fa'aoga sa'o i le fa'aluina o le enzyme, PCR, in vitro transcription, suiga, fa'asologa ma isi su'esu'ega o meaola mole mole.
Tulaga teuina
RNaseA e tatau ona teuina i le -30 ~ -15 ℃ ma felauaiga ile ≤0 ℃ .
Endotoxin Scavenger e mafai ona teuina i le 2 ~ 8 ℃ mo le masina e tasi, teuina i le -30 ~ -15 ℃ mo le teuina umi.ma felauaiga ile ≤0℃ .
O isi vaega e tatau ona teuina i le vevela o le potu (15 ~ 25 ℃) ma felauaiga i le vevela o le potu.
Vaega
| Vaega | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Puipui P1 | 75 ml |
| Puipui P2 | 75 ml |
| Puipui P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Puipui PW | 2 × 22 ml |
| Puipui TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi Columns ( Ta'itasi ile 50ml Collection Tube) | 10 |
| E leai se Endotoxin Tube Collection | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, faʻaaoga e aveese ai le RNA.
Puipui P1:fa'agata fa'ama'i siama, fa'aopoopo le RNaseA i le Buffer P1 a'o le'i fa'aoga muamua.
Puipui P2:faʻamaʻi faʻamaʻi lysis (o loʻo i ai le SDS/NaOH).
Puipui P4:fa'apa'u fa'apa'u.
Endotoxin Scavenger:aveese lelei le endotoxin mai le plasmid extract.
Puipui PW:fufulu pa'u, fa'aopoopo le voluma fa'atonu o le ethanol a'o le'i fa'aoga muamua.
Puipui TB:elution pa puipui.
FastPure DNA Maxi Colums:plasmid DNA adsorption koluma.
Fa'aputuga 50 ml:filtrate aoina faagaau.
E leai se Endotoxin Tube A'oa'i:plasmid DNA aoina faagaau.
Mea Sauniuni
Ethanol atoa, isopropanol, 50 ml lapotopoto-lalo centrifuge faagaau ma 50 ml endotoxin-saolotocentrifuge paipa.
Talosaga
O lenei oloa e talafeagai mo le tele o le aveeseina o plasmids mai le 150 - 300 ml o siama siama.fa'atupu i le po.
Fa'ata'ita'iga Fa'agasologa
1. Ave le 150 - 200 ml (e le sili atu i le 300 ml) o vaifofo siama na totoina i le po ma centrifuge ilee tusa ma le 11,000 rpm (12,000 × g) mo le 1 – 2 min.Lafoa'i le supernatant ma aoina siama.
Δ Pe a aoina le sili atu i le 50 ml o vaifofo siama, e mafai ona aoina le siama e ala i le faaopoopoina o vaifofo siama, centrifugation, lafoai le supernatant ma isi laasaga i le 50 ml tube mo
fa'atele taimi.
2. Fa'aopoopo le 7.5 ml o le Buffer P1 (fa'amolemole siaki pe ua fa'aopoopo le RNaseA ile Buffer P1) ile centrifuge.paipa o lo'o iai siama ma fa'afefiloi mae'ae'a e ala ile vortex po'o le paipa.
Δ O le toe faʻaleleia atoatoa o siama i lenei laasaga e taua tele i le fua mai, ma e le tatau ona i ai ni faʻamaʻi siama pe a uma ona toe faʻafefe.Afai ei ai ni faʻamaʻi siama e le faʻafefiloi lelei, o le a aʻafia ai le lysis, e mafua ai le maualalo o le fua ma le mama.Afai o le OD600 o le vaifofo siama o le 0.65, e fautuaina e faʻaaoga le 7.5 ml o le Buffer P1 pe a aveese mai le 150 ml o vaifofo siama;pe a OD600 o le 0.75, e tatau ona faʻaaogaina le 8 ml o le Buffer P1 ma e tatau ona suia le voluma o Buffers P2 ma le P4 e tusa ai.Afai e faateleina le voluma o le vaifofo siama i le 200 ml, e fautuaina e levoluma o Pa'u P1, P2, ma le P4 fa'aopoopo fa'atatau.
3. Fa'aopoopo le 7.5 ml o le Buffer P2 i le fa'agata fa'ama'i mai le Laasaga 2 ma fa'afefiloi malie i luga ma lalo mo le 6-8.taimi ma incubate i le potu vevela mo 4 - 5 min.
Δ Fa'aliliu lemu ina ia fa'afefiloi lelei.Vortexing o le a mafua ai le genomic DNA fragmentation, e mafua ai le genomic DNA fragment i le plasmid ua maua mai.I le taimi lea, o le vaifofo e avea ma viscous ma translucent, e faʻaalia ai ua maeʻa atoa le siama.O le umi e le tatau ona sili atu i le 5 min e aloese ai mai le faʻaleagaina o plasmids.Afai e le o manino le fofo, atonu e tele naua siama e mafua ailysis le atoatoa, o lea e tatau ona faʻaitiitia le aofaʻi o siama ma le talafeagai.
4. Fa'aopoopo le 7.5 ml o le Pa'u P4 i le fa'amalologa fa'ama'i mai le Laasaga 3 ma vave fa'afo'i malie 6 - 8 taimi e fa'ataga ai le vaifofo e fa'amuta atoa le Buffer P2.I le taimi lea, e tatau ona aliali mai le pa'epa'e pa'epa'e.Centrifuge i le sili atu i le 11,000 rpm (12,000 × g) mo le 10 - 15 min, paipa ma le faaeteete le supernatant i totonu o se fagu centrifuge 50 ml lapotopoto pito i lalo (sauni e le tagata lava ia), ma aloese maifa'asusu le pa'epa'e opeopea.
Δ Faʻaopoopo le Paʻu P4 ma vave faʻafeiloaʻi e faʻafefiloi lelei.Tu'u le paipa e tu se'ia o'o ina fa'asoa fa'atasi le pa'epa'e i le vaifofo e taofia ai le fa'atupuina o timuga fa'apitonu'u e ono a'afia ai le fa'apa'u.Afai e leai se toniga pa'epa'e pa'epa'e pa'epa'e pa'epa'e a'o le'i centrifugation ma le supernatant e le o manino pe a uma centrifugation, o le paipa e mafai onacentrifuge mo le isi 5 min.
5. Faaopopo le 0. 1 taimi le voluma (10% o le voluma sili, e tusa ma le 2.2 ml) o le Endotoxin Scavenger i le supernatant mai le Laasaga 4 ma liliu e faʻafefiloi.Tuu le vaifofo i totonu o se ta'ele aisa pe fa'aofi i totonu o le aisa nutililii (po'o le pusaaisa pusaaisa) mo le 5 minute se'ia o'o ina suia le vaifofo mai le palapala i le manino ma manino (po'o le tumau.teisi le pala), ma fa'afefiloi fa'atele i nisi taimi.
Δ A maeʻa ona faʻapipiʻi le Endotoxin Scavenger i le supernatant, o le a faʻafefete le supa ae o lee tatau ona manino le sua (pe laititi teisi) pe a mālūlū ile ta'ele aisa.
6. A maeʻa ona tuʻuina le supernatant i le vevela o le potu (> 25 ℃) mo le 10 - 15 min, o le a faʻafefe e pei oua faateleina lona vevela i le vevela potu.Ona tatau lea ona fesuia'i le supernatant e fa'afefiloi.
Δ Afai e maualalo le vevela o le potu pe e te manaʻo e faʻaitiitia le taimi e faʻaaogaina ai, e mafai ona faʻafefe le supernatant i totonu o le vai taele 37 ~ 42 ℃ mo le 5 - 10 min ma le isi laasaga e mafai ona faia pe a uma le supernatant.e lelea.
7. Centrifuge le supernatant i le tusa o le 11,000 rpm (12,000 × g) mo le 10 min i le vevela o le potu (o le vevela e tatau ona> 25 ℃) e vavae ese ai le vaega.O le vaega pito i luga o le vai o loʻo i ai le DNA ae o le vaega o le suauʻu lanumoana pito i lalo e iai le endotoxin ma isi mea leaga.Fa'aliliuina leDNA-e iai le vaega vai i se paipa fou matia'i le vaega o le suau'u.
Δ Ole vevela ile centrifugation e tatau ona sili atu ile 25℃ aua e leai se vaeluaga leleitupu pe afai e maualalo tele le vevela.
Δ Afai e le aoga le vavaeeseina o vaega, e mafai ona fetuunai le vevela o le centrifugation i le 30 ℃ male taimi o le centrifugation e mafai ona faateleina i le 15 min.
Δ Aua le mitiia le suau'u lanumoana ona o lo'o iai le endotoxin ma isi mea leaga.
Fa'ainisinia
Toe fa'amama le fa'a'ese'ese
◇ Fa'aopoopo le 7.5 ml Pa'u P1
◇ Fa'aopoopo le 7.5 ml Pa'u P2
◇ Fa'aopoopo le 7.5 ml Pa'u P4
Aveesea o le Endotoxin
◇ Fa'aopoopo 0. 1 taimi le voluma sili o le Endotoxin Scavenger
Nonoa ma Fufulu
◇ Fa'aopoopo 0.5 taimi le voluma ole isopropanol
◇ Fa'aopoopo le 10 ml Buffer PW
◇ Fa'aopoopo le 10 ml Buffer PW
Elution
◇ Fa'aopoopo le 1 – 2 ml Buffer TB po'o le Endotoxin-free ddH2O
