Vaccinia Virus Capping Enzyme

Vaccinia virus capping enzyme e maua mai i le recombinant E. coli strain o lo'o tauaveina kenera mo le Vaccinia capping enzyme.O lenei enzyme e tasi e aofia ai vaega laiti e lua (D1 ma D12) ma e tolu gaioiga faʻamalosi (RNA triphosphatase ma guanylyltransferase e le D1 subunit ma le guanine methyltransferase e le D12 subunit).Vaccinia virus Capping Enzyme e aoga tele e fa'apipi'i ai le fa'avaeina o le pulou, lea e mafai ona fa'apipi'i fa'apitoa le fausaga o le pulou 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) i le pito 5' o le RNA.O le fausaga o le pulou (Cap 0) e taua tele i le mRNA faʻamautu, felauaiga ma faʻaliliuga i eukaryotes.O le tapeina o le RNA e ala i le enzymatic reaction o se auala aoga ma faigofie e mafai ona faʻaleleia atili ai le mautu ma le faʻaliliuga o le RNA mo le faʻaliliuga in vitro, transfection, ma microinjection.

Vaega

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10 × Capping Buffer

Tulaga teuina

-25～- 15℃ mo le teuina （ Aloese mai taamilomilo fa'a'aisa-liu fa'aauau)

Taofi puipui

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Fa'amatalaga Vaega

E tasi le iunite o le Vaccinia virus Capping Enzyme ua faauigaina o le aofaʻi o le enzyme e manaʻomia e tuʻu ai le 10pmol o le GTP i totonu o le 80nt transcript i le 1 itula ile 37°C.

Puleaina lelei

Exonuclease:10U o Vaccinia virus Capping Enzyme ma le 1μg λ-Hind III digest DNA i le 37 ℃ mo le 16 itula e leai se fa'aleagaina e pei ona fuafuaina e le electrophoresis gel agarose.

Endonuclease:10U o Vaccinia virus Capping Enzyme ma le 1μg λDNA i le 37 ℃ mo le 16 itula e leai se faʻaleagaina e pei ona fuafuaina e le electrophoresis gel agarose.

Nickase:10U o Vaccinia virus Capping Enzyme ma le 1 μg pBR322 i le 37 ℃ mo le 16 itula e leai se fa'aleagaina e pei ona fuafuaina e le electrophoresis gel agarose.

RNase:10U o Vaccinia virus Capping Enzyme ma le 1.6μg MS2 RNA mo le 4 itula i le 37 ℃ e leai se fa'aleagaina e pei ona fuafuaina e le electrophoresis gel agarose.

1.coli DNA:10U o Vaccinia virus Capping Enzyme o lo'o su'esu'eina mo le iai o le E. coli genomic DNA fa'aaoga TaqMan qPCR fa'atasi ai ma fa'amatalaga fa'apitoa mo le E. coli 16S rRNA locus.O le E. coli genomic DNA contamination is≤1 E. coli genome.

2.siama Endotoxin: LAL-suʻega, e tusa ai ma le Chinese Pharmacopoeia IV 2020 lomiga, gel limit test method, tulafono lautele (1143).E tatau ona ≤10 EU/mg mea e maua i le endotoxin siama.

Faiga ma tulaga

1. Polokalama Tapuni (volo tali: 20 μL)

O lenei faiga e faʻatatau i le faʻaogaina o le 10μg RNA (≥100 nt) ma e mafai ona faʻalauteleina e tusa ai ma manaʻoga faʻataʻitaʻiga.

I) Fa'atasi le 10μg RNA ma le Nuclease-free H2O i totonu o le 1.5 ml microfuge tube i se voluma mulimuli o le 15.0 μL.*10×Pepa Fa'amau: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) Fa'avela ile 65 ℃ mo le 5 minute sosoo ai ma le ta'ele aisa mo le 5 minute.

3) Faʻaopoopo vaega nei i le faʻatonuga ua faʻamaonia

*10×Pepa Fa'amau:0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) Fa'asusu ile 37°C mo le 30 minute, ua tapunia nei le RNA ma sauni mo fa'aoga i lalo.

2. 5′ fa'amau fa'ailoga tali (volo tali: 20 μL)

O lenei feagaiga ua mamanuina e faʻailoga ai le RNA o loʻo iai le 5' triphosphate ma e mafai ona faʻalauteleina e tusa ai ma manaʻoga.O le lelei o le tu'ufa'atasia o igoa o le a a'afia i le fua molar o le RNA: GTP, fa'apea fo'i ma le GTP i totonu o fa'ata'ita'iga RNA.

1) Fa'atasi le aofa'i talafeagai o le RNA ma le Nuclease-free H2O i totonu o le 1.5 ml microfuge paipa i se voluma mulimuli o le 14.0 μL.

2) Fa'avela ile 65 ℃ mo le 5 minute sosoo ai ma le ta'ele aisa mo le 5 minute.

3) Faʻaopoopo vaega nei i le faʻatonuga ua faʻamaonia.

** GTP MIX e faasino ile GTP ma se numera itiiti o maka.Mo le fa'atonuga o le GTP, fa'asinoi le Faamatalaga 3.

4) Fa'asusu ile 37°C mo le 30 minute, RNA 5′ fa'ai'uga ua fa'aigoaina ma sauni mo lalo ifo.

Talosaga

1. Fa'amauina le mRNA a'o le'i faia su'ega fa'aliliu/fa'aliliuga in vitro

2. Fa'ailoga 5' pito o le mRNA

Fa'amatalaga ile fa'aogaina

1.O le fa'avevelaina ole vaifofo ole RNA a'o le'i fa'ao'o ile Vaccinia Capping Enzyme e aveese ai le fausaga lona lua ile pito 5' ole tusitusiga.Fa'aopoopo le taimi ile 60 minute mo tusitusiga fa'atasi ai ma 5' ends e iloa lelei.

2. O le RNA e fa'aogaina mo le fa'aogaina o tali e tatau ona fa'amama a'o le'i fa'aogaina ma fa'agata ile vai e leai ni fa'ama'i.E le tatau ona iai le EDTA ma e tatau ona leai ni masima le vaifofo.

3. Mo le fa'ailogaina o le fa'ai'uga 5', o le aofa'i o le GTP e tatau ona tusa ma le 1-3 taimi le maualuga o le molar o le mRNA i le tali.

4. O le voluma o le faiga tali e mafai ona faʻalauteleina i luga pe lalo e tusa ai ma le mea moni.